同型半胱氨酸对卵子质量及体外受精妊娠结局的影响

发布时间：2020-07-22 13:20:18来源：泰怡康成

摘要

目的探讨同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)对女性卵子质量及其体外受精(IVF)妊娠结局的影响。方法收集124对准备行IVF助孕夫妇的女方卵泡液及血液标本。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定月经周期第3天血清与取卵日卵泡液中Hcy的水平;分析卵泡液、血清Hcy水平与卵子及胚胎参数、及其IVF助孕妊娠结局的关系。结果按照IVF助孕结局将女性患者分为受孕组和未受孕组，其中两组间卵泡液Hcy水平存在显著差异(P＜0.05)，其他参数间未见显著性差异(P＞0.05)。卵泡液Hcy水平与卵泡直径显著相关(r=－0.318P＜0.05)，与其他参数无相关性;血清Hcy水平与卵子及胚胎参数无相关性(P＞0.05)。结论同型半胱氨酸对女性生育力可能存在一定的影响。卵泡液同型半胱氨酸水平与卵泡直径存在关联性。关键词:女性;卵泡液;血清;同型半胱氨酸;IVF

同型半胱氨酸(Hcy)是体内蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要中间产物。近些年国内外一些研究发现，体内Hcy的水平升高，会对男性和女性的生育力产生一定程度的影响［1－2］，同时还影响胚胎的质量［3－4］。目前，国内关于Hcy对体外受精(IVF)的研究的报道尚少。本研究旨在探讨Hcy对女性卵子质量及其对IVF妊娠结局的影响。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1研究对象收集

2015年10月－2016年5月在唐山市妇幼保健院准备接受体外受精(IVF)助孕(第1周期)的124对夫妇的女方基本资料。其中年龄(32.5±4.1)岁，BMI(24.6±3.6)kg/cm2，不孕时间(5.1±3.9)年，IVF男方因素34例(27.4%)，女方因素71例(57.3%)，共同因素17例(13.7%)，不明原因2例(1.6%)。同时收集以上患者月经周期第3天的血清及取卵日当天的卵泡液:抗苗勒氏管激素(AMH)水平为(4.5±2.1)ng/ml，卵泡刺激素(FSH)水平为(6.5±2.2)mIU/ml，血清Hcy水平为(18.8±7.1)μmol/L，卵泡液Hcy水平为(7．8±4.2)μmol/L。排除年龄＞40周岁，诊断有子宫内膜异位症或输卵管积水，以及FSH＞15mIU/ml和LH＞15mIU/ml的患者，同时排除近3个月服用影响生育力药物的患者及其他不符合卫生部规定指征的患者。本项研究已经过医院伦理委员会批准，所有提供精液样本的患者均已签署书面知情同意书。

1.1.2标本制备

取卵过程中，取出直径＞14mm的成熟卵泡，并将每个患者的第一管卵泡液统一单独收集待测，保证没有血液及其他污染。收集卵子后，置于ZONKIALC－180离心机，将卵泡液以2500r/min，离心10min，分离红细胞、白细胞及颗粒细胞等成分。分装标记后存放于－70℃冰箱待统一测定。收集患者空腹静脉血于自凝管，血液在室温自然凝固10～20min后，置于ZONKIALC－180离心机，以2500r/min，离心20min。仔细收集上清，分装标记后存放于－70℃冰箱待统一测定。按试剂盒说明书留取标本，标本不可有溶血、乳浊、严重黄疸。

1.2方法1.2.1IVF基本流程

月经第21天或排卵后7d(经前黄体中期)，排除卵巢生理性囊肿、巧克力囊肿，及给予短效GnＲH－a(天兴，成都天山台制药有限公司)降调节，降调节14～21d达垂体降调节，根据患者年龄、BMI、双侧窦卵泡数给予Gn(丽申宝，丽珠集团丽珠制药厂)启动量，同时继续给予短效GnＲH－a，促排卵期间根据B超及激素测定调整Gn用量，当至少有3个优势卵泡直接达20mm，参考激素水平停用促排卵药和GnＲHa，当晚肌肉注射r－hCG(艾泽，雪兰诺欧洲公司)250μg，注射36h后，阴道超声下取卵。取卵后4～6h行常规IVF或ICSI授精，取卵后72h进行胚胎移植。移植后14d检测尿早早孕或检测血hCG以确定是否妊娠，对检测阳性者于移植后28d行阴道B超检查。

1.2.2标本的检测卵泡液及血清Hcy水平的测定采用北京百奥莱博科技有限公司的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，其试验批内误差＜9%，批间误差小于15%;AMH测定采用广州市康润生物科技有限公司的ELISA试剂盒，其试验批内误差＜10%，批间误差＜15%;FSH测定西门子公司的化学发光法试剂盒，其试验批内误差＜10%，批间误差＜15%。

1.2.3卵子及胚胎评级

根据Istanbul共识对卵母细胞成熟度以及卵裂期胚胎进行分级。在体视显微镜下观察卵冠丘复合物，并对其进行分级:细胞核结构尚未消失，胞浆中可见一完整球形核为GV(Germi-nalVesicle)期卵;细胞核结构消失，第一极体尚未排出，被评为MⅠ期卵;细胞核结构消失，在卵黄间隙中可见第一极体呈月牙状，紧贴卵黄膜，卵周间隙小或无，为AMⅡ期卵;细胞核结构消失，在卵黄间隙中可见第一极体，胞浆匀称、浅色、颗粒均匀，被评为MⅡ期卵;具有完整或碎裂的第一极体，胞浆圆形对称，变黑或呈颗粒状，有时甚至可见空泡，为过熟期卵;有任何形式的核，胞浆呈棕色或黑色，形状很不规则，透明带呈锯齿状，被评为退化或闭锁卵。倒置显微镜下观察卵裂期胚胎，并进行评级:卵裂球大小均匀、形态规则，透明带完整，胞质均匀清晰，胚胎内碎片＜10%为1级;卵裂球大小略不均匀、形态略不规则，胞质可有颗粒现象，胚胎内碎片10%～20%为2级;卵裂球大小明显不均匀、可有明显形态不规则，胞质可有明显颗粒现象，胚胎内碎片21%～50%为3级，卵裂球大小严重不均匀，胞质可有严重颗粒现象，胚胎内碎片＞50%为4级。优质胚胎标准:第2天:≥4C、≥2级。第3天:≥7C、≥2级。

1.3统计学分析采用SPSS15.0软件对获得数据进行分析处理。首先检验卵泡液Hcy水平、血清Hcy水平等的数据分布否为正态分布。分别对相应数据进行卡方检验、t检验、非参数检验和Spearman相关性分析。设定P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1按IVF助孕结局分组的比较研究

按IVF助孕结局是否成功妊娠，将患者分成受孕组和未受孕组。两组间卵泡液Hcy水平比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，血清Hcy水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。两组间其余各指标比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2血清、卵泡液Hcy水平与卵子、胚胎质量评价参数的相关性分析

经正态性检验，血清、卵泡液Hcy水平及为偏态分布。Spearman相关性分析结果见表2。结果显示卵泡液Hcy与卵泡直径存在显著相关性(P＜0.05)。卵泡液Hcy水平与卵泡直径相关性散点图见图1。

3讨论

近些年Hcy代谢途径对生育力方面的影响逐渐引起广泛重视［5－6］。目前，国内关于Hcy对生育力方面影响的研究报道还比较少。本研究招募124对接受IVF助孕夫妇的女性患者，对其血清Hcy、卵泡液Hcy及卵子、胚胎的相关参数的检测结果结合其IVF助孕妊娠结局的研究［7］发现，受孕女性和未受孕女性两组间卵泡液Hcy水平存在显著差异，而且卵泡液Hcy水平与卵泡直径大小存在关联性。因此推断Hcy对女性生育力可能存在一定的影响。

本研究按照接受IVF助孕的妊娠结局，将女性患者分为受孕组和非受孕组，其中两组间卵泡液Hcy水平存在显著差异(P＜0.05)，其余各项指标均未见显著性差异(P＞0.05)。卵泡液作为卵子的微环境，卵泡液中包括很多营养物质、酶和激素来保证卵子正常代谢和功能，水平过低或过高都会对卵子发育产生一定的影响。基于本次研究，这很可能是卵泡液中高水平Hcy的毒性作用通过活性氧(ＲOS)的作用导致。Berker等［8］和Aitken等［9］在研究中发现，卵泡液中高水平的Hcy可以引起卵细胞分裂减少，碎片增加。而且，Berker等［8］发现，优胚培养环境中Hcy的平均水平低于较差胚胎培养环境中Hcy的平均水平。此外，Szymanski等［10］等的研究也发现，暴露于低水平Hcy的卵子会表现出更好的质量和更高的成熟度，即卵泡液中Hcy水平与卵子质量存在显著相关性。本研究与Pelin等［7］的研究得出了相同的结论。在本研究中，关于卵泡液Hcy水平与总卵泡数、卵子成熟度和胚胎分级均未见显著相关性。

在关于卵泡液Hcy与卵子参数关系的研究中，发现卵泡液Hcy水平与卵泡直径存在显著相关(r=－0.318，P＜0.05)。血清Hcy与卵子、胚胎参数无相关性。研究表明，卵泡液中较高水平的Hcy可能会限制卵泡的生长。然而，Boxmeer在两次研究中却得出了相反的结论［2，11］。Boxmeer等［2］认为，由于两次研究测定的Hcy水平水平接近，可能是样本量较小导致。除此之外，卵泡液是卵巢多种细胞的代谢活动产物以及血清渗出物等组成的混合物。目前还尚不清楚卵泡液中Hcy水平的影响因素及其升高所带来的影响。Hcy作为一种硫醇诱导释放的ＲOS对卵子成熟和受精过程非常重要，即卵泡液中某个生理剂量的ＲOS对卵泡成熟和排卵是必需的［12－13］。而且，先前的一些研究显示经过IVF助孕成功的女性卵泡液ＲOS显著高于未成功的女性［14－15］。但是，高水平的Hcy有直接的细胞毒性:内膜的损伤，氧化应激物质(ＲOS)的过度产生，转甲基作用受到抑制，基因的异常表达［16］。同时，有研究报道在胚胎培养基中高水平的ＲOS会导致卵裂率降低，胚胎碎片增加以及胚胎形成率下降［17］。本次研究的结论显示高Hcy水平对卵子的成熟是有害的，主要表现在卵泡的直径。这很可能是氧化应激的结果。有研究［2］报道，在接受IVF助孕的促排卵期间，血清中Hcy水平的降低有利于卵泡的成熟。在未来的研究中，需要进一步确认卵泡液中Hcy水平是否为判断卵子质量的的预测指标。基于以上的研究，卵泡直径的范围可能反映出卵泡是否处在适宜的微环境。所以，可以推断出卵泡液Hcy有可能是在某范围内发挥积极作用，过高或过低都有可能对生育力产生不利影响。因此，未来的研究应该探索适宜的卵泡液Hcy的水平范围区间，以减低对卵子的不利影响。

本研究还存在一些局限性:首先，本次研究的病例数比较少，研究结论容易产生偏倚。其次，本研究只是在接受IVF助孕的人群中开展，缺乏自然周期的对照组。同时，本次研究招募的，接受IVF助孕的女性患者病因组成较混杂，如未严格区分年龄及接受IVF助孕指征等因素。在未来的研究中，应该把该研究扩展至自然周期并对女方进行更加严格的分组。第三，本次研究每位患者的各个卵泡未单独区分收集，而是把每位患者的各个卵泡液混合统一检测。第四，关于Hcy的测定，由于卵泡液中蛋白质的水平比较高，从而增加了标本的检测难度;同时卵泡液中容易混入血液，引起误差的概率比较大。

随着Hcy对生育力的影响逐渐引起广泛关注。在未来的研究中应该克服上述关于本研究的局限性，主要包括:增加样本量;增加自然周期的对照，对接受IVF助孕的患者依据其病因进一步分组;把每位患者的各个卵泡液单独保存并检测其Hcy水平;改进Hcy的测定方法。Hcy作为甲硫氨酸循环和半胱氨酸代谢的重要中间产物，叶酸缺乏和Hcy的堆积会导致高同型半胱氨酸血症，进而对生育力产生不利影响。因此，在未来的研究中不应只局限于Hcy的研究，而是扩展至叶酸、维生素B12、维生素B6等Hcy代谢途径的相关物质对女性生育力影响的研究。

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作者：赵铭佳1，吴剑华1，李翠1，张鸥1，刘宝莲1，蒋凯1，柳月娟2，朱研峰3，宁艳春1，罗萌萌1，苏兴1，崔静1，韩宝生1

来源：中国妇幼保健

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