陈思凡/严励/李梓伦/邓凯合作发现糖尿病及其并发症、新冠病毒感染代谢并发症的潜在治疗新方法
发布时间：2022-02-15 18:25:42来源：idiabetes
概要
血管紧张素转换酶2（ACE2）是肾素-血管紧张素系统（RAS）的重要组成部分，参与维持代谢稳态，同时也是介导新冠病毒入侵人体的受体蛋白。中山大学孙逸仙纪念医院陈思凡研究员联合多个团队合作发现：胰岛素抵抗、新冠病毒感染均可导致ACE2功能下调，系两种病理状态下机体出现相关代谢并发症的潜在共同通路；而对ob/ob胰岛素抵抗小鼠过表达ACE2可有效改善小鼠糖脂代谢紊乱；鉴于目前尚未有作用明确的ACE2激活剂，合作团队利用中山大学“天河二号”超级计算机高通量筛选小分子化合物，结合CMAP生物信息学数据库及生物学实验验证，最终鉴定出伊马替尼（imatinib）、醋甲唑胺（methazolamide）及哈巴俄苷（harpagoside）3种新型ACE2酶活性激动剂；通过对高脂饲喂的胰岛素抵抗小鼠的体内实验，明确伊马替尼、醋甲唑胺可通过激活ACE2改善胰岛素抵抗小鼠糖脂代谢紊乱、抑制肝脏脂质堆积及肾脏糖基化产物堆积；而通过对新冠病毒感染的肥胖小鼠实验，明确上述2种化合物可通过激活ACE2酶活性抑制新冠病毒感染引起的糖脂代谢恶化及肝肾组织的代谢损伤，并通过改变ACE2构象，抑制新冠病毒刺突蛋白与ACE2结合，进而减少病毒入侵。
本研究表明，激活ACE2可能是糖尿病及其并发症、新冠诱发的代谢并发症防治的新治疗靶点与思路。
研究背景
根据2020年中国糖尿病流行病学调查，我国18岁以上人群2型糖尿病患病率为11.2%，患病人数达到1.58亿。糖尿病可导致心脑血管病变、糖尿病肾病、糖尿病足、视网膜病变等并发症，具有高致死或致残率，严重威胁人类健康[1]。虽然已明确胰岛素抵抗是导致2型糖尿病的关键病理机制，但由于胰岛素抵抗下游调控的靶点及通路复杂，其促进糖尿病及其并发症进展的分子机制尚未明确，这是糖尿病领域的研究热点。
新冠病毒感染可导致全身多组织器官损伤[2-4]。据报道，新冠病毒感染可导致5%~29%的患者出现新发糖尿病[5-7]及其他各类代谢并发症[8,9]，但具体机制尚不清楚；而目前针对新冠病毒感染的治疗药物主要作用机制是中和病毒，抑制病毒入侵、复制、组装等，虽可有效减少感染前期的病毒载量，但对病毒载量较低的重症期、病毒清除后的“后遗症期”造成的代谢并发症无直接作用，新冠代谢并发症防治存在难点。
为探究糖尿病及其并发症、新冠病毒感染诱发的代谢并发症的核心机制，陈思凡研究员及其合作团队对糖尿病、糖尿病肾病、高血压、动脉粥样硬化、新冠病毒感染的基因变化特征进行了联合分析，发现ACE2下调为新冠病毒感染与糖尿病等多种代谢疾病发生发展的共同通路。ACE2蛋白在糖脂代谢调控与新冠病毒感染中均扮演重要角色：一方面，ACE2是RAS的重要组成部分，ACE2可剪切血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）为Ang-(1-7)，ACE2、Ang-(1-7)和其受体MasR组成抗炎抗氧化轴，参与维持代谢稳态[10-12]；另一方面，ACE2是介导新冠病毒入侵人体的受体蛋白[13]。既往认为，提高ACE2的蛋白表达可能会增加病毒感染的风险，因此推测可通过抑制ACE2来防治新冠病毒感染[14,15]。
合作团队通过研究颠覆了这一观念，率先发现ACE2催化功能受损可能是导致新冠代谢并发症的关键因素。但因目前尚缺乏作用明确的ACE2酶活性激动剂[16]，限制了该通路在医学上的转化应用。因此，合作团队通过高通量筛药及生物学验证，鉴定出伊马替尼、醋甲唑胺及哈巴俄苷3种新型ACE2酶活性激动剂，并证明通过激活ACE2可有效改善糖尿病及新冠病毒感染诱发的代谢并发症。
这一研究创新性地发现ACE2通路下调是介导糖尿病及新冠肺炎导致的代谢并发症的关键机制，并首次鉴定出ACE2的酶活性激动剂，为糖尿病及其并发症、新冠诱发的代谢并发症防治提供了新的治疗靶点与思路。研究成果于2022年2月11日发表在国际著名学术期刊CellMetabolism，题为ImatinibandmethazolamideameliorateCOVID-19-inducedmetaboliccomplicationsviaelevatingACE2enzymaticactivityandinhibitingviralentry。
研究结果
ACE2在代谢性疾病及COVID-19引起的代谢紊乱中起重要调控作用
大量临床研究结果表明，SARS-CoV-2感染者会产生明显的代谢紊乱。COVID-19患者可出现高血糖、高血压、低HDL-C、肾小球病变、内皮功能障碍和血栓形成等异常，这些与糖尿病、高血压、糖尿病肾病和动脉粥样硬化的相关表现类似。合作团队推测，上述4种代谢性疾病共享的基因通路变化可能是导致COVID-19相关代谢紊乱的核心通路。因此，合作团队利用DisGeNET和OpenTarget两个数据库，分别筛选出在这4种代谢性疾病中发生显著改变的前400个基因，发现各有48个和72个基因在4种疾病中发生显著变化，再将两个数据库的结果合并后得到20个潜在的核心基因（图1A-C）。然后，合作团队又比较了这20个基因在不同SARS-CoV-2感染转录组中的表达情况，发现ACE2呈现明显下降趋势（图1D）。同时，对新冠患者和健康对照者血浆中ACE2酶底物AngⅡ及其产物Ang-(1-7)定量结果也显示，ACE2酶活性下降，且随着疾病严重程度而进一步降低，并在病毒清除后的恢复期仍然较低（图1E）。体外实验中，SARS-CoV-2感染人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）后，ACE2mRNA和蛋白水平显著下降（图1F和G），酶活性显著降低（图1H）。
在ob/ob肥胖小鼠中过表达ACE2，可发现葡萄糖耐量、空腹血糖、胰岛素敏感性等糖代谢指标明显改善，几乎可恢复到正常健康小鼠的水平（图1I-M）；同时，肥胖小鼠肝脏内的脂肪堆积（图1N）、肾小球糖基化产物堆积（图1O）均明显改善；而肥胖小鼠左心室射血分数（LVEFs）及短轴缩短率（FS）恢复到接近正常水平（图1P）。这提示，过表达ACE2可有效改善糖尿病及其相关并发症，寻找其潜在激动剂可能是治疗糖尿病及新冠代谢并发症的新策略。
图1.ACE2在代谢性疾病及COVID-19引起的代谢相关紊乱中起重要调控作用
伊马替尼、哈巴俄苷和醋甲唑胺是3种新型ACE2酶活性激动剂
虽然既往研究认为2个化合物XNT和DIZE可能是ACE2激动剂[17]，但Haber等发现XNT在ACE2敲除小鼠中仍然有降压效果，而体外及大小鼠肾脏离体实验也证实XNT和DIZE不能增强ACE2酶活性[16]。因此，尚未有真正的ACE2酶活性激动剂被发现。合作团队通过两种非偏倚的方法来筛选潜在的ACE2激活剂：（1）筛选可直接与ACE2结合并增加其酶活性的潜在ACE2酶活性激动剂；（2）筛选通过转录水平增加ACE2表达的潜在ACE2转录激活剂。首先，合作团队通过“天河二号”超级计算机虚拟对接，从InterBioScreen和DrugBank数据库的76639种化合物中，筛选出924种潜在可直接结合并激活ACE2的化合物；同时，通过使用CMAP（connectivitymap）数据库和与ACE2转录激活相关的特征基因，筛出83种可潜在的转录激活ACE2的化合物。最后，通过CMAP和SARS-CoV-2感染的特征基因，筛出176种可能改善新冠病毒感染的化合物。将前两者的结果分别与后者结果取交集再合并，共得到15种化合物（图2A）。ACE2虚拟对接位点如图2B所示。
合作团队通过体外实验进一步对这15种化合物进行验证（图2C）：首先，使用这15种化合物分别处理HUVECs，发现其中8种可调控ACE2下游基因（G6PC、GLUT2、PPARα、PPARγ、TNF-α和IL-6）的mRNA水平（图2D）；接着，用炎症因子预处理HUVECs以下调ACE2，再用上述8种化合物干预，发现其中6种可显著逆转ACE2表达下调导致的代谢基因改变（图2E）；最后，使用上述6种化合物处理ACE2敲降的HUVECs，发现其中3种（伊马替尼、哈巴俄苷和醋甲唑胺）对细胞代谢的调控是ACE2依赖性的（图2F）。
图2.伊马替尼、哈巴俄苷和醋甲唑胺是3种新型ACE2酶活性激动剂
伊马替尼、哈巴俄苷和醋甲唑胺可直接结合并激活ACE2
合作团队通过Biacore实验，发现伊马替尼、哈巴俄苷和醋甲唑胺可与纯化的ACE2蛋白直接结合，其平衡解离常数（Kd值）分别为12.7μM、86.1μM和70.0μM，而阳性对照DIZE的Kd值为5.9μM，阴性对照Xanthone（Xan）不能与ACE2结合（图3A-E）。进一步利用“天河二号”超级计算机，通过分析ACE2蛋白与伊马替尼或醋甲唑胺结合的分子动力学模拟，发现它们之间结合的潜在位点（图3F和G）。体外细胞的酶活性实验进一步证明这3种化合物处理HUVECs后，ACE2酶活性显著提高（图3H）；此外，在细胞裂解液中，3种化合物对ACE2酶活性的激活作用呈时间与剂量依赖效应（图3I-L）。
图3.伊马替尼、哈巴俄苷和醋甲唑胺可直接结合并激活ACE2
伊马替尼和醋甲唑胺可通过激活ACE2通路改善胰岛素抵抗小鼠的糖脂代谢紊乱
鉴于3种ACE2激动剂中，伊马替尼、醋甲唑胺分别是治疗白血病或青光眼的临床药物，可以“老药新用”快速进入临床试验。因此，合作团队使用伊马替尼和醋甲唑胺分别处理高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠，结果发现，干预后小鼠的葡萄糖耐量、胰岛素敏感性、空腹血糖、胰岛素与HOMA-IR水平均得到明显改善（图4A-E）。血浆炎症因子TNF-α水平显著降低（图4F），肝脏的脂肪变性明显改善（图4G）。对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠，通过将AAV-shACE2经肾盂注射，从而在肾脏组织特异性敲低ACE2，并使用伊马替尼、醋甲唑胺分别处理，发现两种药物对肾脏的保护作用明显下降：血浆KIM-1和肌酐（CREA）水平显著回升（图4H和I），PAS染色显示对肾小球糖基化产物堆积的抑制作用也受阻（图4J）；药物下调的肾脏Glut2、Tnf-αmRNA水平也有所回升（图4K）；药物下调的血浆AngⅡ/Ang-(1-7)比值也有所回升（图4L），提示两种药物均依赖ACE2通路发挥改善糖脂代谢的作用。
此外，胰岛素抵抗小鼠的肾脏和主动脉的ACE2酶活性在受到药物干预后显著升高（图4M和N），进一步证明这两种化合物可直接增加体内ACE2的酶活性。而ACE2下游受体MasR拮抗剂A779可阻断糖耐量和胰岛素敏感性等代谢指标的改善（图4O和P），提示伊马替尼、醋甲唑胺通过调控ACE2酶活性而改善代谢紊乱。
图4.伊马替尼和醋甲唑胺可通过激活ACE2通路，改善胰岛素抵抗小鼠的代谢紊乱
ACE2酶活性激动剂改善SARS-CoV-2感染造成的代谢并发症，并抑制病毒入侵
合作团队利用伊马替尼和醋甲唑胺分别处理人源化ACE2的肥胖小鼠，随后对小鼠进行SARS-CoV-2的感染。发现病毒感染后，ACE2酶活性下调，而药物干预后可恢复到正常水平（图5A）。感染后空腹血糖没有发生明显改变（图5B），但血浆胰岛素（图5C）和HOMA-IR（图5D）水平在病毒感染后显著上调，提示处于胰岛素抵抗的早期阶段，而药物干预后，胰岛素抵抗得到明显改善（图5C和D）。感染后血浆和肝脏中的TG、TC水平升高，药物干预后得到逆转（图5E-H）。同样，PAS染色结果显示，药物干预后可明显改善感染造成的肾小球损伤（图5I）。
此外，合作团队发现药物干预可显著改善病毒感染所致的肺损伤（图5J）；且肺内病毒核衣壳蛋白（NP）水平显著降低（图5K）。进一步使用3种ACE2激活剂分别处理病毒感染的VeroE6细胞，发现可显著降低细胞培养基中的病毒RNA水平（降低89.1%~99.9%）（图5L）。进一步利用3种化合物处理细胞，发现干预后融合了Spike蛋白的“假病毒”入侵明显降低（图5M）。最后，合作团队通过co-IP实验进一步验证3种化合物可显著降低ACE2与病毒刺突Spike蛋白之间的结合（图5N）。
图5.ACE2酶活性激动剂改善SARS-CoV-2感染造成的代谢并发症，并抑制病毒入侵
讨论
RAS在调控糖脂代谢及胰岛素敏感性中发挥重要作用，与糖尿病及其并发症的发生发展紧密相关。RAS系统主要由两条轴组成：血管紧张素原由肾素转化为AngⅠ，AngⅠ被ACE剪切为AngⅡ，ACE、AngⅡ和其受体AT1R组成促炎促氧化轴；而AngⅡ被ACE2剪切为Ang-(1-7)，ACE2、Ang-(1-7)和其受体MasR组成抗炎抗氧化轴，两条轴共同维持机体代谢稳态。既往研究发现，通过ACE2重组蛋白或Ang-(1-7)受体激动剂等方式可激活ACE2通路而改善代谢紊乱，但ACE2重组蛋白因其分子量较大难于进入特定脏器[18]，而Ang-(1-7)受体激活剂如AVE0991尚有待临床验证其效果[19]。因此，开发ACE2酶活性激动剂可有效推动这一领域发展。
在研究团队鉴定出的3种ACE2酶活性激动剂中，伊马替尼既往被报道为BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，可用于治疗慢性粒细胞白血病[20]。醋甲唑胺既往被报道为碳酸酐酶抑制剂，可用于治疗青光眼[21]。既往个别研究提示伊马替尼及醋甲唑胺可促进胰岛素敏感性[22,23]，但具体机制未知。本研究明确两种药物可通过激活ACE2，改善糖脂代谢紊乱，改善糖尿病及新冠代谢并发症。因此，两种药物有望快速进入相关临床试验，以应用于糖尿病及新冠代谢并发症的防治。
另外值得提出的是，ACE2是新冠病毒刺突蛋白的结合受体，介导病毒进入细胞[13]。研究表明，过表达ACE2可增加病毒入侵，而利用抗体封闭ACE2可抑制病毒感染[24]。因此，既往认为可通过抑制ACE2来防治新冠病毒感染[14,15]。但合作团队通过研究颠覆了这一观念，率先发现新型ACE2激动剂干预新冠病毒感染的小鼠，不但可有效改善病毒感染，且或可有效纠正新冠病毒感染引起的代谢并发症；同时证实，ACE2激动剂是通过结合ACE2改变其构象，从而抑制新冠病毒刺突蛋白与ACE2结合，显著降低病毒入侵细胞。
这一研究首次鉴定出新型ACE2酶活性激动剂，阐明ACE2激动剂一方面可通过激活ACE2通路改善糖脂代谢紊乱，另一方面可通过改变ACE2构象抑制新冠病毒入侵，“双管齐下”地改善COVID-19相关代谢并发症（图6）。这一研究成果为糖尿病、新冠病毒感染等疾病的防治提供了重要的新思路。
图6.新型ACE2酶活性激动剂改善糖尿病及新冠的代谢并发症
中山大学附属第一医院李梓伦副主任医师、中山大学中山医学院邓凯教授及中山大学孙逸仙纪念医院严励教授为本文共同通讯作者，中山大学孙逸仙纪念医院陈思凡研究员为最后通讯作者。李梓伦、彭梅秀、陈品、刘陈枢、胡奥为该文共同第一作者。本研究得到合作方中山大学计算机学院（国家超级计算广州中心）卢宇彤教授的大力支持和指导。
专家介绍
陈思凡
中山大学“百人计划”引进人才，中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心研究员
博士毕业于德国海德堡大学，博士后工作于哈佛医学院附属波士顿儿童医院。主持国自然基金、广东省杰青、广州市重点研发等项目。任中国生物物理学会肠道菌群分会理事，中国生物物理学会代谢生物学分会青年理事。从事2型糖尿病的分子调控机制及防治的研究，主要集中在：（1）研究菌群及其代谢产物对糖尿病及其并发症的调控；（2）筛选新的天然植物化学物作为开发防治代谢性疾病的潜在药物。论文以（共同）通讯或第一作者发表在CellMetabolism（2篇）、MolecularCell、SignalTransductTargetTher、NatureCommunications和TheFASEBJournal等杂志。
陈思凡实验室长期面向海内外招聘博士后及研究助理，请感兴趣的同学直接通过电子邮件（chensf26@mail.sysu.edu.cn）联系PI以作进一步交流。PI信息详见：http://www.gzsys.org.cn/node/14871。
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参考文献
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（来源：《国际糖尿病》编辑部）
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